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His标签蛋白和镍柱不结合怎么办?

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更新时间:2019年12月13日14:53:01 打印此页 关闭
摘要: .含有his标签蛋白的细胞(菌体)破碎释放蛋白时的破碎功率不合适(太小蛋白未能完全释放,太大蛋白碳化),此时就要优化细胞破碎的方法和条件。2.his未表达或者his蛋白表达过程中his丢失,必要时增加蛋白序列中his的个数并确保正确表达,可通过WB的方式去验证是否有表达。3.his标签在蛋白高级结构中暴露的不完全被包裹在蛋白结构里面,此时就要用6-8M尿素或...

.含有his标签蛋白的细胞(菌体)破碎释放蛋白时的破碎功率不合适(太小蛋白未能完全释放,太大蛋白碳化),此时就要优化细胞破碎的方法和条件。


2.his未表达或者his蛋白表达过程中his丢失,必要时增加蛋白序列中his的个数并确保正确表达,可通过WB的方式去验证是否有表达。


3.his标签在蛋白高级结构中暴露的不完全被包裹在蛋白结构里面,此时就要用6-8M尿素或盐酸胍使his标签暴露出来,同时要明确还有变性剂的样品最佳镍柱是IMAC/NTA 。

4.缓冲液体系不合适,上样缓冲液及平衡缓冲液中螯合剂,还原剂及咪唑的含量影响结合,应确保不含有螯合剂,还原剂,咪唑含量控制在10mM以内。另外缓冲液的pH也不宜太低,应控制在7.3-8.5之间。


5.层析过程中流速过快,蛋白和镍柱接触时间太短。此时就要降低流速增加蛋白和镍柱的接触时间,确保足够的结合过程。


6.镍柱没有平衡好,特别是新的镍柱里面有保存液20%的乙醇,在开始使用时,要将乙醇彻底清洗干净,并用pH7.3-8.5的缓冲液充分平衡,使镍柱达到可以结合his蛋白的状态,在开始上样结合。


7.样品中his蛋白的丰度太低或者镍柱的载量太低也会导致his蛋白和镍柱不结合,若样品丰度太低,首先要对其进行浓缩,在上样,或者选择质量好载量高的镍柱。


8.CHO等细胞分泌表达的his蛋白,体系中通常含有螯合剂和还原剂和常规镍柱结合效果很差,甚至不结合,此时就要先置换缓冲液体系在上样(置换体系可用脱盐柱),或者用高耐受的镍柱(Ni  TED),但是必须要清楚高耐受的镍柱比IMAC/IDA的镍柱的载量要低很多,结合力也要弱很多。