在线客服
热线电话
  • 13458592595
      

DNA,siRNA成功转染的关键点

分享到:
点击次数:3983 更新时间:2020年01月19日12:54:39 打印此页 关闭

一、质粒DNA细胞转染实验,应注意以下几点

1、质粒的大小和质量

   线性化还是超螺旋会影响转染结果:超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多,特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟,相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大,又没有经验,选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分,使得DNA形成转染复合物时更致密一些,更容易转染一些。纯化质粒的质量也会影响转染效率,一定要选择高质量的质粒。

2、质粒DNA的浓度和量       

    做转染实验,质粒的纯度是一定要的。OD值260/280在1.8左右,是一个基本的指标,即没有蛋白和RNA 污染。最重要的是内毒素要清除干净。内毒素清除的效果,才是是否用于转染的决定指标。既然质粒纯化已经不成问题,初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA,但是要注意的是,DNA量过少固然转染效率不高,DNA量过多同样会降低转染效率。所以预实验需要按照说明书的要求,按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。有的转染试剂要求DNA的量多些,有的转染试剂效率高只要很少DNA。

3、转染试剂的选择

   在确定了质粒的质量之后,就要考虑转染试剂的选择了。目前大多数用的是脂质体类的转染试剂,但这类试剂的毒性较大,转染效率低,最好选择非脂质体的转染试剂,如Entranster试剂。

二、成功siRNA转染的主要关键点有什么?

      1.设计合成有效的siRNA

    RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计合成首先很重要,最优的设计可以用最小的工作浓度取得满意的沉 默效果,减少副反应的发生。siRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA。需要强调的是,需要同时设置阴性对照以排 除非特异沉默现象和阳性对照以确认整个实验体系的有效性。

     2.合成的siRNA注意纯度和工作浓度

      siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA,siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。

   3.选择合适的siRNA转染试剂

     选择合适的siRNA转染试剂是的RNAi实验成功另一个关键。由于细胞毒性对siRNA实 验的影响非常大,可以直接影响实验结论和结果,所以一定选择低毒性的转染试剂,看一个转染试剂毒性是否低,有一个简单的方法,看转染的过程和要求,比如要 求的细胞密度越大,说明毒性越大,比如转染复合物容许和细胞孵育的时间越短,说明毒性越大。除了低毒性,还最好操作简便,越简单越好,比如有的转染试剂要 求转染前换无血清培养基或低血清培养基,转染后又要有血清培养基,实际上,由于培养条件的频繁变化,可能会对细胞表达模式产生影响,对后续的mRNA和蛋 白分析也同样产生影响,最终影响实验的可靠性。

   4、健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

  通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

siRNA转染后细胞死亡

原因也是多样的,如脂质体毒性,转染浓度过高,转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生,这种情况下就需要适当优化转染条件;可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂,如Entranster试剂,另外,如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的,出现细胞死亡的现象可能正是由于基因干扰引起的,如果由于细胞死亡而影响检测的话,可以适当调整检测时间。实验条件的优化,包括转染前细胞密度调整,转染浓度,检测时间等。

       siRNA沉默效率的检测

   1.PCR检测mRNA水平的沉默效果,一般推荐在48h到72h检测吧。可能48h比较理想吧。需要具体的摸所时间。

   2.WB检测蛋白蛋白水平的检测,一般在转染后48h到92h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果,检测时间跟你的蛋白的半衰期有关系,具体的时间需要设计时间梯度,一般理想的是在72h最明显。

   3.PCR检测沉迷效果时,在设计引物的时候最好是将引物设计在沉默位点的两侧,而不是在同侧。这个是由于RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。这个可能切割和降解具有不同的时间点。即使不能设计在同侧,也不要离沉默位点太远的地方。不然可能会造成对沉默效果的低估。

   4.关于siRNA的阳性对照。如果你的实验中出现了siRNA的转染效率很高能够达到70以上,而siRNA的沉默效率始终很低的话,这个时候你需要怀疑你的siRNA的效果问题了。这个时候可以做下siRNA的阳性对照。阳性对照有actin和gapdh等。基本有针对这些基因的特异性的高效的siRNA序列。




上一条:siRNA转染与DNA转染对应转染试剂的区别? 下一条:Cellvis激光共聚焦耗材选择