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蛋白纯化中层析介质的品质影响因素

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点击次数:1303 更新时间:2019年11月29日11:55:08 打印此页 关闭

一:基质材料

    层析介质常用的基质材料有无机化合物组成硅胶,也有有机化合物组成的聚苯乙烯,还有纯化生物大分子最常用的多糖聚合物(琼脂糖,葡聚糖,纤维素)等。


   1.硅胶系列的介质,其刚性大,但不耐碱,多用于制备正反向层析介质,在小分子化合物提取分离,特别是植物提取行业广泛应用,也多用于分析型色谱柱介质的制备。

   2.聚苯乙烯系列填料,刚性较强,层析过程传质速度高,但是其亲水性差疏水性强,生物相容性差,多用于多肽,生物碱等物质的分离提纯,也有少部分用于生物大分子纯化。

   3.多糖系列层析介质,目前有琼脂糖微球,葡聚糖微球,琼脂糖交联葡聚糖微球,琼脂糖交联纤维素微球等为基质制备而成的各种层析介质,广泛用于疫苗,抗体,蛋白,血液制品,生长因子,酶的分离纯化,其生物相容性良好。如Focudex G-25广泛用于生物大分子的脱盐,是葡聚糖交流纤维素制备而成的凝胶过滤介质,而Focurose 4FF广告用于疫苗的分离纯化,是交联琼脂糖制备而成的凝胶过滤介质等。

  

   交联琼脂糖制备而成的介质应用最为广泛,如GE公司的Sepharose FF系列介质,在离子交换介质,亲和介质,疏水介质制备上应用最为广泛。

   葡聚糖交联纤维微球介质,如GE公司Sephadex系列介质,在生物大分子脱盐及小分子多肽分离纯化中广泛应用。

   葡聚糖交联琼脂糖微球介质,如GE公司的Sepharose XL介质,其即可避免介质和蛋白结合的空间位阻,又提高了可利用配基的密度,从而大幅度提高了介质的载量,比FF基质的填料有明显的载量优势,也广泛用于生物大分子的分离纯化。

  琼脂糖交联纤维微球介质,如GE公司的Capto,此类介质比琼脂糖微球的介质有更高的耐压性,在使用时有更高的传质速率,有更优秀的品质,在收率,载量,分辨率方面都有明显优势,此类基质的多糖介质是多糖介质发展的趋势,但因其生产工艺复杂,成本高目前还未完全取代琼脂糖微球介质。

  二:介质流速    

    介质的流速指在给定的条件下,如给定压力,给定柱床高度,给定缓冲液类型测的数值,不同方法测定的流速不一样。

     1.同一材质的介质,粒径越小流速越小。

     2.同一材质的介质,装填高度越高流速越小。     

     在使用过程中即要保证料液和介质足够的接触时间,又要保证合适的流速,这需要摸索实验确定最佳控制流速。

 三:孔径

         层析介质孔径分布,不同的测定方法测定出来差异较大。不同物质分离纯化在孔径选择上略有差异。不同孔径分布的纯化介质吸附解吸附的热动力学过程有差异。不同孔径分布的纯化介质耐压性,载量,结合结合强度方面有差异。

      生物大分子纯化层析介质,以多糖基质的居多,交联琼脂糖制备而成的介质应用最为广泛,如GE公司的Sepharose 4FF和6FF系列,在离子交换介质,亲和介质,疏水介质制备上应用最为广泛。其中4FF的平均孔径是40nm,而6FF的平均孔径是27nm。100KD以内的物质优选6FF基质的介质,100KD到1000KD的物质优选4FF基质的介质。

     葡聚糖交联琼脂糖微球介质,如GE公司的Sepharose XL,其即可避免介质和蛋白结合的空间位阻,又提高了可利用配基的密度,从而大幅度提高了介质的载量,比FF基质的填料有明显的载量优势,也广泛用于生物大分子的分离纯化。如DEAE Focurose 6XL在肝素钠及胰蛋白酶的分离纯化中表现出良好的品质,广泛用于天然蛋白的分离纯化。XL系列的填料孔径平均在36nm左右。纯化小于100KD的物质优选。

    琼脂糖交联纤维微球介质,如GE公司的Capto此类介质比琼脂糖微球的介质有更高的耐压性,在使用时有更高的传质速率,有更优秀的品质,在收率,载量,分辨率方面都有明显优势,此类基质的多糖介质是多糖介质发展的趋势,但因其生产工艺复杂,成本高目前还未完全取代琼脂糖微球介质。此类填料的平均孔径在35nm左右。

 四:粒径    

     1.同一材质的介质,粒径越小装柱后有更高的理论塔板数,所以粒径越小分辨率越高。

     2.同一材质的介质,粒径越小同样体积的介质比表面积越大,所以载量越高。

     3.同一材质的介质,粒径越小装柱后反压越大,流速越小。

     4.同一材质的介质,粒径越小理论塔板数越高,其回收率也随粒径的变小而增大。这可能与分辨率越高,在收集时开始收集状态更好把控有关。

     5.同一材质的介质,粒径分布的越均一或分布区间越小,装填后理论塔板数就越高,分辨率就越高。粒径一致的介质称为单分散介质,其分辨率最高,当然粒径分布对填料的影响同时遵循粒径大小对介质性能的影响,如单分散为60um的介质比单分散粒径为25um的介质的分辨率要低。

    6.同一粒径分布范围的介质,分布区间的正太分布区间越小,越集中,其分辨率越高。

    7.同一粒径分布范围介质,平均粒径也会影响其品质和性能,平均粒径偏小分辨率高,但是流速小,偏大流速大,但是分辨率低。如都是45-165um范围的介质,平均粒径为75um的就比平均粒径为100um的装填后反压要大,分辨率要高。

    8.同一材质,同一粒径分布范围的填料(如琼脂糖FF系列介质),不同厂家在粒径的均一性上相差较大,最终也会导致在载量,流速,分辨率等方面差异较大。同一材质的介质,粒径越小往往价格越高。

      粒径分布的特征:

     粒径分布包括两个方面平均粒径和粒径范围。

     1.硅胶系列介质的粒径,目前市场上有单分散微球(粒径均一的,从10um---100um的都有),也有不定型的(介质颗粒是不规则的形状的,粒径分布宽泛),单分散的比不定型的品质要好很多,当然价格也贵很多。

    2.聚合物系列介质的粒径,目前市场上单分散微球居多,粒径从10um到200um的都有。

    3.多糖系列介质,粒径分布都是一定的范围,GE公司的Sepharose 4FF和6FF系列,都是90um,粒径范围在45-165um. 如GE公司的Sepharose HP系列介质平均粒径都是37um,粒径分布都25--45um。如GE公司的Sepharose Big Beads系列介质平均粒径都是200um,粒径范围都是165um到300um.

五:介质选择和分辨率

   了解介质的选择性先从介质的结构开始,除凝胶过滤介质是要靠填料的孔和微球之间的间隙去分配不同物质的,离子,亲和,疏水三种吸附层析介质都有一定的选择性,其选择性是由介质结构中的配基决定的。一个介质的配基确定后,其可识别的分子或基团就确定了,介质的选择性顾名思义也就是其识别能力。

     介质的选择性是介质的一个特征,选择性由其配基决定,亲和的选择性最高,大多亲和介质都趋于一对一的精准识别,疏水介质的分辨率也很高,离子交换介质识别带一类电荷的物质,相比亲和选择性就要差一些。

介质的分辨率是介质分离物质的能力描述,这与多方面因素有关。

    1.介质的粒径越小,装柱后理论塔板数越高,分辨率也越高。如GE公司的Sepharose FF系列介质的分辨率就要比GE公司的Sepharose HP系列介质的分辨率小,也因此HP系列的介质称为高分辨率介质。

    2.在一定范围内,介质的结合载量的提高会导致其分辨率下降。

    3.介质装填时,随装填高度的增加分辨率也增加,但是反压也增大。

    4.层析缓冲液也会影响介质的分辨率,比如离子交换介质使用时,用2M NaCl直接洗脱,此时就失去了分辨带不同电荷物质的能力。

    5.层析过程的控制也会影响介质的分辨率,比如流速,通常流速增大分辨率降低。

    6.介质的保养及清洗也会影响介质的分辨率,使用后要及时对介质进行CIP,避免沉积在介质中的杂质影响分离过程,导致介质的分辨率下降。

     不同类型的介质选择性和适用性有差异,选择性通常是和适用性融合起来的,一种介质能识别某种物质,那么这个物质就适用此介质来纯化。

六:配基密度和载量

    配基密度与介质的基质材料有关,不同的基质其表面用来交联配基的基团不一样且活过过程及活化方式影响很大。如GE公司的Sepharose FF系列就比Sepharose 4B/6B可用来交联的基团就要少。  

     琼脂糖微球介质:4B(4%琼脂糖)--CL-4B(低强度交联)--4FF(高强度交联),刚性逐渐增强,耐压性提升,但是在交联的过程中部分基团已经被占据,所以可交联上去的配基逐渐减少,制备的介质配基密度逐渐减小。交联配基的条件及过程控制应做相应调整,与此同时每交联一次,或多或少都会产生一些非特异性吸附的基团,对介质的品质产生一定的影响,从4B到4FF,非特异性吸附逐渐增大。

   2.配基密度与介质的粒径还有关,粒径越小比表面积越大,可用来交联配基的基团也就越多,所以同一材质小粒径制备而成的介质比大粒径制备成的介质配基密度要高

   载量

    1.理论上介质的配基密度越高其载量越高,但是实际上载量不仅与介质的配基密度有关,而且与配基的交联方式有关,而交联方式影响更大。活化方式,活化的过程控制绝对介质结构中的间隔臂,间隔壁通常不影响介质的配基密度,单对介质的载量影响较大。如GE公司的Sepharose FF系列介质就比GE的Sepharose XL系系列的载量要低很多,配基密度差异并不大。

   2.动态载量是在一定条件下即模式使用过程(孵育时间/上样流速,柱床高度,缓冲液,固定的样品)测得一个数值。也意味着同一介质用于不同的样品其动态载量有差异。

   3.静态载量即饱和载量,也在固定条件下让介质充分和样品接触,以达到饱和吸附,以此测的数据为静态载量,对使用指导意义不大,市售介质参数描述的载量都指的动态载量。

    4.介质的动态载量与测定蛋白的种类,结构性质,分子量都有很大关系,也与测定时的流速等有关,而且测定时通常用的单一的蛋白测定,然而在我们使用介质纯化蛋白时,通常和介质结合的不仅有目标蛋白还有杂蛋白,所以我们推荐在使用介质时先对样品的蛋白浓度做出预估,并且上样量控制在介质载量的50%以内,避免蛋白流穿降低回收率。在使用时可通过优化层析条件或延长介质和料液的接触时间(降低流速)来保证介质的载量。   

    5.介质的载量也影响其识别及结合能力。

    6.介质的载量也与其粒径大小及孔径大小有关,载量的表征是很多因素综合的一个结果。   

    7.介质的载量影响其分辨率,载量提升,其结合能力增强,但是特异性识别能力减小。载量升高分辨率下降。

    8.载量受很多因素影响,也会影响介质的性能,所以我们在选择介质的时候切勿盲目一味追求高载量,不同纯化阶段,需考虑不同的因素,所以我们在选择介质的时候要根据我们项目的属性,综合评估去选择合适的介质。

七:清洗、保存   

     层析介质的维护是层析介质寿命的关键影响因素。层析介质在使用过程,物料和其接触后,洗脱之后,残留的蛋白,核酸,内毒素,色素及缓冲液中的杂质也污染了介质,这些污染物不仅影响介质的性能,也会污染目标产品,通过再生,清洗及消毒的方式去除这些污染的过程通称为介质的维护。

    1.再生

    恢复介质的原有功能,每使用一个循环后进行。

*离子交换介质用2M氯化钠流经柱床2个CV即可达到再生的目的。

*Ni Focurose 6FF IMAC介质的再生通常需要用1M的咪唑加1M的氯化钠进行再生,同样也流经柱床2CV.

*疏水层析介质通常用纯水或低浓度的缓冲液进行再生。

*凝胶过滤介质通常用2M氯化钠再生。

2.清洗(CIP):

    去除再生没有去除的杂质及介质中积累的污染物,所以清洗过程比再生过程往往要剧烈,清洗要根据层析介质的类型耐受性,物料的性质,层析介质所处的工艺阶段,层析柱及层析系统的耐受性等综合考虑清洗的状态,通常使用1-10个循环清洗一次,同时要选择合适的清洗试剂。

     通过试验证明清洗有效且污染物的残留及清洗试剂残留已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。清洗验证可通过检测载量,流速及清洗试剂残留的方式去验证。因此不同的工艺过程,介质的清洗有不同的操作模式和方法,清洗验证是整个目标物制备工艺中的一部分。

3.消毒:

    层析介质的消毒主要作用是去除层析介质中的微生物以及内毒素等有害物质。每一批物料处理完后都要对介质进行消毒。常用的消毒方式是使用0.5-1M的氢氧化钠和介质接触30-60min。特别注意,部分介质不耐受氢氧化钠或者只耐受低浓度的氢氧化钠,如Protein G Focurose 4FF介质不耐受氢氧化钠,此时就要选择其它方式,比如用70%的乙醇进行消毒等。另外消毒过程往往会和清洗过程重合,消毒也可作为清洗的一部分。

4.保存:

a.未使用的层析介质通常都是保存在20%的乙醇中,常温保存(4-35度),亲和介质有一部分需要在4度保存。

b.装填在层析柱的介质保存,需要保存在湿度小洁净的环境中(建议万级),常用10mM的氢氧化纳作为保存剂,亲和介质用20%乙醇作为保存剂。








  




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